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徒手切割法體細胞克隆研究進(jìn)展
日期：2025-04-21 01:44
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摘要：
1997年2月，英國<Nature》雜志報道了英國羅斯林研究所的Wilmut等利用綿羊乳腺細胞進(jìn)行核移植試驗，成功地獲得了世界上**只體細胞克隆綿羊——多利(Dolly)。這一成果有力地證明了成年哺乳動(dòng)物的體細胞仍具有發(fā)育上的全能性，從而開(kāi)創(chuàng )了哺乳動(dòng)物細胞核移植的新里程碑，在生物科學(xué)史上具有十分重要的意義。到目前為止，體細胞克隆技術(shù)已相繼在多種動(dòng)物上獲得成功，并顯示出巨大的應用潛力和社會(huì )效益。
目前影響動(dòng)物體細胞核移植廣泛應用的主要技術(shù)因素有：
(1)核移植效率低；
(2)實(shí)驗所需設備費用高。技術(shù)難度大；
(3)妊娠率和產(chǎn)仔率低，出生后死亡及異常發(fā)育率高。
在克隆過(guò)程中成熟卵母細胞去核是核移植技術(shù)中的一個(gè)重要環(huán)節。要求去得干凈，又盡可能地減少對細胞質(zhì)的損傷。如果去核不完全，可導致重組胚染色體的非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。而如果要保證去核勢必要損失細胞質(zhì)，否則要使用熒光染色技術(shù)。目前使用的主要是顯微操作去核，需要價(jià)格昂貴的顯微操作儀和熟練的技術(shù)操作人員。此外，還需要相關(guān)的輔助工具制作設備如研磨機、微鍛爐等，而對其使用也需一定的技術(shù)水平。這些要求相當程度地限制了核移植技術(shù)的簡(jiǎn)化及廣泛應用。研究不需要顯微操作設備的核移植技術(shù)將會(huì )對體細胞核移植技術(shù)的實(shí)際應用起到巨大推動(dòng)作用。
1 HMC技術(shù)
徒手切割法體細胞克隆(Handmade Somatic Cell Cloning，HMC)是一項不需要顯微操作的核移
植方法，*早是Peura等 進(jìn)行牛胚胎細胞克隆時(shí)建立的，Vajta等【3 進(jìn)一步發(fā)展了此方法，成功應用
于牛的體細胞核移植，并且得到后代 。HMC技術(shù)路線(xiàn)主要包括卵母細胞的去透明帶，徒手切割半卵
法去核，雙半卵融合、激活，以及支持無(wú)透明帶卵／胚胎培養技術(shù)。
1．1 卵母細胞去透明帶
1．2 卵母細胞的去核
1．3 卵母細胞的融合
目前常用的是電融合，根據電融合的次數可以分為一步法和兩步法。融合的電壓與動(dòng)物的種類(lèi)有關(guān)。BLS細胞融合儀是一款專(zhuān)門(mén)為哺乳動(dòng)物設計的細胞融合儀，產(chǎn)品小,易操作,性?xún)r(jià)比極高.HMC技術(shù)結合BLS細胞融合儀CF-150B的使用,已成為此領(lǐng)域研究人員的理想選擇.
1．3．1 一步法
在電融合槽中一次同時(shí)將2枚去核后的半卵和1枚供核體細胞粘合在一起進(jìn)行融合，從而提高電擊融合效率。
具體做法是：
將半卵細胞與供體細胞先放入含有植物凝集素(PHA)的TCM～HEPES液滴中，通過(guò)圓頭粘合細玻璃針撥動(dòng)使一枚半卵先與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚半卵粘在一起，其排列順序為：體細胞一半卵～半卵，然后進(jìn)行電融合。在融合槽中施加交流電場(chǎng)，可使已經(jīng)粘成一串的3個(gè)細胞自動(dòng)排序，再給與直流電脈沖，可以一次性同時(shí)融合處理14個(gè)3細胞串，從而大大提高融合效率。電擊后3Orain內觀(guān)察融合情況，沒(méi)有融合的再進(jìn)行電擊一次。
在牛的電融合實(shí)驗中，其融合率達到(95．68±3．97) ]。利用一步融合法已經(jīng)生下5頭體細胞克隆牛
犢。也可以采用先將一枚半卵與一枚供體細胞用PHA法粘合，然后放入融合槽時(shí)再加入一枚半卵。
通過(guò)手工撥動(dòng)使粘有體細胞的半卵與另一枚半卵排序，然后通過(guò)提供一定電壓的交流電場(chǎng)使3個(gè)細胞
緊密聯(lián)結在一起，再應用直流電脈沖一次性使3個(gè)細胞融合，一次可以融合處理4對細胞。
1．3．2 兩步法
相對一步法而言，主要是進(jìn)行兩次電融合。
具體過(guò)程：
半卯與供體細胞經(jīng)過(guò)有植物凝集素(PHA)的TCMHEPES液滴的處理后，一枚半卵先與供體細胞融合，融合后的半卵再與另一枚半卵進(jìn)行融合，但是**次融合的電壓要比**次的低。根據Vajta等的報道，經(jīng)過(guò)兩次融合，融合率可以達到76。運用此法進(jìn)行核移植也得到克隆牛犢-4。j。
1．4 卵母細胞的激活
激活處理主要是化學(xué)激活，與常規相同。但也有化學(xué)激活與電激活相結合的。采用化學(xué)激活時(shí)去
透明帶的卵母細胞在二甲氨基嘌呤(DMAP)中采用微穴培養系統(WOW)培養法，一般每孔3O～100
個(gè)，具體依據實(shí)驗的細胞數目而定。Kragh等 用HMC技術(shù)進(jìn)行豬的體細胞核移植時(shí)使用化學(xué)激活和
電激活相結合的方法，激活率為(49±1) 。
1．5 重構胚的培養
與傳統核移植重構胚的培養方法不同，HMC的胚胎由于去除了透明帶，其培養系統必須要能夠防
止重構胚的相互粘連，因而采用隔離法群體培養。
1．5．1 微穴培養系統(well of the well，WOW)
WOW *先報道于Vajta等 ，其簡(jiǎn)要過(guò)程如下：在四孔培養皿中加入培養液并覆蓋石蠟油預熱，然后用胚胎聚集針通過(guò)手腕用力并旋轉，在培養皿的底部均勻分布地壓下30～70個(gè)(視每組實(shí)驗培養的卵母細胞數而定)圓錐形小凹。小凹的底部直徑約為120n，上口直徑約300 f』m，深度約為350 n 。
1．5．2 明膠一孔系統
用胚胎培養液無(wú)牛血清白蛋白(BSA)和氨基酸]溶解明膠，濃度為19／6。在四孔板的孔中鋪上一層明膠，然后加入胚胎培養液并在上面覆蓋石蠟油。用直徑為5O～100rn的塑料小管在明膠上作孔，每孔放一個(gè)胚胎進(jìn)行培養。
1．5．3 微管法培養(GO 系統)
GO系統(the glassoviductsystem)就是將重構胚放人一端封Vi的毛細玻璃管中，玻璃管徑的大小要適宜，將培養液加入到玻璃管中然后進(jìn)行培養。Thouas等在研究小鼠的合子體外發(fā)育時(shí)，發(fā)現GO系統培養的囊胚其內細胞團、滋養外胚層以及早期桑椹胚的細胞數目明顯高于微滴法培養囊胚的細胞數，但操作不如微滴法簡(jiǎn)便。
1．6 核移植胚胎的冷凍
2 HMC技術(shù)的應用前景
與常規核移植方法相比，HMC技術(shù)*大的特點(diǎn)是對實(shí)驗設備的要求相對而言不是太高，不需要顯
微操作儀，而且對技術(shù)人員的要求也降低許多。常規去核方法主要依靠**極體定位，因此需要必須是有**極體排出的成熟卵母細胞；而HMC技術(shù)則不需要那么嚴格，只要成熟的卵母細胞細胞質(zhì)均勻即可，從而可以提高卵母細胞的利用率。但HMC技術(shù)需要兩個(gè)卵母細胞才能得到一個(gè)重組胚，因而從整體上限制了核移植的成功率，但是核移植的效率卻可以大大提高。此外由于在融合時(shí)兩個(gè)半卵胞質(zhì)體來(lái)自不同的卵母細胞再加上供體細胞，重構胚的DNA有可能來(lái)源于三方面，對胚胎的進(jìn)一步發(fā)育可能會(huì )產(chǎn)生影響。
目前通過(guò)此方法得到克隆動(dòng)物還不多，只有牛的成功報道，但是在其他動(dòng)物如豬 、綿羊現在也展開(kāi)了研究，并且取得了一定進(jìn)展。Vanessa等用HMC技術(shù)進(jìn)行牛的體細胞連續核移植(SHMC)，成功得到一頭小牛。同時(shí)HMC技術(shù)有獨特的優(yōu)勢如進(jìn)行胚胎嵌合的研究]?？傊?，HMC技術(shù)由于其獨到的優(yōu)勢，將會(huì )促進(jìn)核移植技術(shù)的發(fā)展。隨著(zhù)該方法進(jìn)一步的提高和完善，HMC技術(shù)在哺乳動(dòng)物的體細胞克隆胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中將發(fā)揮重要作用。
BLS細胞融合儀與HMC技術(shù)相結合,以成為該領(lǐng)域研究人員的理想選擇
