顯微鏡相關(guān)知識

用于顯微注射用的顯微鏡常使用具有相差(phasecontrast) 與微分干涉(differential interference contrast) 功能的倒置顯微鏡( 例如奧林巴斯的倒置顯微鏡IX 系列) 。

倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統顛倒，一般正置顯微鏡的物鏡在載物臺之上，照明系統在下，而倒立式顯微鏡為物鏡在下，照明系統在載物臺之上。倒置顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)為物鏡與目鏡間的工作距離較長(cháng)，可直接將培養皿置于顯微鏡操作臺上進(jìn)行顯微注射等工作。

傳統的普通光學(xué)顯微鏡無(wú)法直接觀(guān)察未經(jīng)染色的透明活細胞，為了能讓顯微注射技術(shù)觀(guān)察與操作透明的活細胞樣品，顯微鏡必須使用具有相差與微分干涉功能的倒置顯微鏡。

相差顯微鏡是由P.Zernike 于1932 年發(fā)明的，并因此獲得1953 年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡*大的特點(diǎn)是可以觀(guān)察未經(jīng)染色的透明標本和活細胞。相差顯微鏡的基本原理是利用透明細胞檢體內部折射率的各不相同，把透過(guò)標本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，得到明暗對比的效果，使得透明活細胞各種結構內部細節在亮背景視野中變得清晰可見(jiàn)。

相差顯微鏡的基本構造是利用相差聚光鏡及內部相環(huán)所構成的環(huán)狀光圈，當光通過(guò)聚光鏡后，產(chǎn)生中空光錐，并在光線(xiàn)穿過(guò)檢體后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了 1/4λ （波長(cháng)），如果再經(jīng)過(guò)物鏡內的光延遲位環(huán)板而成增加或減少1/4λ ，則光程差變?yōu)?/span>1/2λ ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小提高反差。

雖然相差顯微鏡可以為透明的細胞樣品提供清晰的觀(guān)察圖像，但是一般相差顯微鏡的缺點(diǎn)是會(huì )有“光暈”現象產(chǎn)生。因而導致觀(guān)察的景深受限制，無(wú)法用來(lái)觀(guān)察較厚的樣品。較厚的細胞團區域在一般相差顯微鏡下的清晰度十分糟糕，而且邊緣常產(chǎn)生暈輪效果，如果觀(guān)察樣品中有超過(guò) 85% 以上的區域為較厚細胞時(shí)，這個(gè)問(wèn)題將非常嚴重。然而顯微注射的樣品如受精卵細胞或細胞團均具有一定厚度，造成細胞結構和邊緣無(wú)法清楚可見(jiàn)，因此顯微注射用的顯微鏡必須要能克服厚樣品的問(wèn)題。

為解決活動(dòng)樣品和厚樣品帶有“光暈”的觀(guān)察問(wèn)題，1952 年，Nomarski 在相差顯微鏡原理的基礎上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope ）。Nomarski 微分干涉差顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是能顯示結構的三維立體投影影像。與傳統相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強，產(chǎn)生類(lèi)似于浮雕的效果。

微分干涉差顯微鏡技術(shù)設計比相差顯微鏡要復雜得多，Nomarski DIC 利用的是偏振光，具有四個(gè)特殊的光學(xué)組件：偏振器（polarizer ）、DIC 棱鏡、DIC 滑行器和檢偏器（analyzer ）。偏振器直接裝在聚光系統的前面，使光線(xiàn)發(fā)生線(xiàn)性偏振。在聚光器中則安裝了二個(gè)楔形單軸的晶體 , 如石英, 以光軸互相交錯的方式互相接合，稱(chēng)為Wollaston 棱鏡或Nomarski 棱鏡，即DIC 棱鏡。此棱鏡可將每一光線(xiàn)分離成為二條偏振互相垂直的兩束光（x 和y ），二者成一小夾角，聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向。*初兩束光相位一致，在穿過(guò)標本相鄰的區域后，由于標本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了**個(gè) Wollaston 棱鏡，即DIC 滑行器，它把兩束光波合并成一束，這時(shí)兩束光的偏振面（x 和y ）仍然存在。*后光束穿過(guò)**個(gè)偏振裝置，即檢偏器，在光束形成目鏡DIC 影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角，檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。 x 和y 波的光程差決定著(zhù)透光的多少，當光程差值為0 時(shí)，沒(méi)有光穿過(guò)檢偏器；光程差值等于波長(cháng)一半時(shí)，穿過(guò)的光達到*大值，于是在灰色的背景上，標本結構便呈現出亮暗差。為了使影像的反差達到*佳狀態(tài)，觀(guān)察者可通過(guò)調節 DIC 滑行器的縱行微調來(lái)改變光程差，改變光程差可以改變影像的亮度。而調節DIC 滑行器則可使標本的細微結構呈現出正或負的投影形象，通常是一側亮，而另一側暗，這便造成了標本的人為三維立體感，產(chǎn)生了類(lèi)似大理石上的浮雕感覺(jué)。 DIC 顯微鏡使細胞的內部結構，特別是一些較大的細胞器，如核、線(xiàn)粒體等，立體感特別強，因此適合應用于顯微操作技術(shù)。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常需要在這種顯微鏡下進(jìn)行。

  雖然 Nomarski 微分干涉技術(shù)可以對付一些細胞團或者組織等較厚的樣品，但它非常昂貴，并且僅僅只能應用在玻璃底的培養皿中，無(wú)法直接在廣為研究人員進(jìn)行細胞培養操作的一般塑料材質(zhì)的培養皿產(chǎn)生浮雕效果，此外這種技術(shù)對于顯微操作技術(shù)的所使用的樣品而言，景深還是稍嫌不足，因此在應用上遇到不少問(wèn)題。有鑒于此，一些其它的可以用于觀(guān)察厚樣品的微分干涉技術(shù)也逐漸被開(kāi)發(fā)出來(lái)。例如 OLYMPUS 奧林巴斯公司就推出了自己的浮雕相襯（ RC ）裝置奧林巴斯浮雕相襯系統能夠產(chǎn)生高反差的 3D 圖像，類(lèi)似于 DIC 效果，可用于塑料器皿中的樣品。浮雕相襯用于細胞受精，使細胞核膜更容易看到和穿刺。適用于所有類(lèi)型的細胞 , 組織 ( 無(wú)論活體 , 染色 , 未染色 ), 晶體表面細節 , 透明聚合物 , 玻璃和其它類(lèi)似材料 , 尤其適應于顯微操作實(shí)驗。