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活體電穿孔法原理、特點(diǎn)和應用
日期：2025-04-19 19:29
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摘要：1、什么是活體電穿孔
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過(guò)電場(chǎng)作用，導入動(dòng)物目標組織或器官。由于這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用，并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡(jiǎn) 單，在直流電場(chǎng)作用的瞬間，細胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復。在此期間生物大分子如DNA 可通過(guò)這種微小的通道進(jìn)入細胞。近年來(lái)活體電穿孔法用于轉基因研究的報道不斷增多，在基因**方面的優(yōu)勢也日趨顯著(zhù)，是一種很好的活體基因導入方法。
活體電穿孔法...
1、什么是活體電穿孔
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過(guò)電場(chǎng)作用，導入動(dòng)物目標組織或器官。由于這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用，并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡(jiǎn) 單，在直流電場(chǎng)作用的瞬間，細胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復。在此期間生物大分子如DNA 可通過(guò)這種微小的通道進(jìn)入細胞。近年來(lái)活體電穿孔法用于轉基因研究的報道不斷增多，在基因**方面的優(yōu)勢也日趨顯著(zhù)，是一種很好的活體基因導入方法。
活體電穿孔法可用于檢測瞬時(shí)表達系統中載體的表達狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因**方面有非常好的應用前景。因此目前國內外對活體電穿孔法介導外源基因轉移的研究越來(lái)越多。
2、活體電穿孔的法的特點(diǎn)
活體電穿孔法基因導入和表達效率較高，它的特點(diǎn)主要在以下幾個(gè)方面:
首先，靶器官的選擇面廣，理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。
在用于基因**方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細胞不能把所轉移基因的表達產(chǎn)物分泌到外周血液循環(huán)中，則在某種意義上說(shuō)已失去了 基因導入的價(jià)值，這在基因**中是關(guān)鍵性的問(wèn)題。當使用組織特異性表達載體時(shí)，研究人員應根據所構建的表達載體來(lái)選擇基因轉移和表達的靶器官組織。例如魚(yú) 精蛋白21 啟動(dòng)子可指導外源基因在精母細胞中特異性表達，以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚(yú)精蛋白21啟動(dòng)子的表達載體導入，獲得外源基因的表達量遠遠高于該基因在肝 臟和骨骼肌中的表達。
其次，對導入的外源基因片段的大小沒(méi)有限制，從幾KB 或十幾KB 的表達載體， 到100～200KB 的YAC、BAC基因組 ，都有成功導入并獲得表達的報道。
此外活體電穿孔法操作簡(jiǎn)單快速，電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘，而且DNA片段不需要特殊的純化操作。
但電穿孔法也存在一些的缺點(diǎn):首先，外源基因表達持續的時(shí)間很短，雖然外源基因導入后*快可在215 小時(shí)有表達，但大多1～2 月后表達量降至很低。外源基因表達的時(shí)間主要由于所構建的表達載體和基因導入的靶細胞組織器官不同而存在巨大差異。
由于應用不同的表達載體，Muramatsu 在小鼠肝臟進(jìn)行電穿孔7天后則檢測不到外源基因的表達，而Heller 21 天后還可以檢測到外源基因的表達。如果選擇代謝和酶活動(dòng)旺盛的組織器官如肝臟，則表達持續時(shí)間會(huì )較短，表達時(shí)間在1 個(gè)月以?xún)?，但以骨骼肌為靶組織，表達可持續15個(gè)月。
3、 活體電穿孔法與其他活體基因導入方法的比較
到目前為止，非病毒載體的活體基因導入方法有直接注射法、脂質(zhì)體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性，因此很難將這幾種方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較。
直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點(diǎn)或血管中，但此種方法不適合以肌肉作為靶器官，它的外源基因表達效率極低，僅為電穿孔法的百分之一。
脂質(zhì)體法：活體基因轉移法中脂質(zhì)體法更適宜較大面積組織的基因導入，但無(wú)法避免DNA濃度變低，在出血的情況下會(huì )使本來(lái)不高的DNA濃度更加降低，往往造成基因導入效率低。
基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質(zhì)地較堅韌的組織如皮膚，而視網(wǎng)膜、胚胎和禽類(lèi)的胚盤(pán)等組織會(huì )由于機械刺激和出血造成器質(zhì)性損傷或發(fā)育停滯，因而不能 用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發(fā)出到達組織表面大多只幾百微米的距離，較深層的組織不易操作， 表達效率也較低。
Muramatsu報道在材料一致的情況下，電穿孔法的基因導入和表達效率明顯高于其它方法，而且電穿孔法適合多種組織的操作[3 ] 。
4 、活體電穿孔法施加條件的研究
波型的選擇
在電穿孔過(guò)程中方波較指數衰減波更能獲得較高的基因表達。同時(shí)方波只要要求控制電壓和時(shí)間，十分直觀(guān)，而指數衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數，這樣的條件摸索過(guò)程中，方波較指數衰減波更易得到高表達。
電 壓
電穿孔時(shí)在能量導入一定的情況下設計施加電壓的值。電壓過(guò)低或過(guò)高都會(huì )影響外源基因的表達。電壓過(guò)低時(shí)，無(wú)法造成細胞膜表面狀態(tài)的改變，因而外源D 不能進(jìn)入細胞內。電壓過(guò)高時(shí)，局部組織積聚過(guò)多熱量，造成細胞的死亡或組織失去功能，即使外源基因導入細胞，也無(wú)法進(jìn)行正常的表達。哺乳動(dòng)物常用的活體電 壓大多為20～100VPcm ，*高電壓在250～750VPcm。
電穿孔次數和時(shí)間
有試驗證明，皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說(shuō)明電穿孔使皮下組織形成孔道，且其大小隨電穿孔而變大，經(jīng)過(guò)電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內表達。但電穿孔次數不能過(guò)多，否則會(huì )對局部的細胞組織造成不可逆的損害，基本應在10 次以?xún)龋?/span>
每組電穿孔時(shí)間應在20～100msec 。
能量的測算
電穿孔過(guò)程中能量的測算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時(shí)導入的能量，V 代表施加的電壓，T 代表電穿孔延續的時(shí)間，R 代表作用組織的電阻。試驗證明在導入能量一定的情況下外源基因轉移效率也相近。在此原則基礎上可根據不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時(shí)間。
溫 度
由于電穿孔瞬間在局部會(huì )產(chǎn)生大量熱，因此操作過(guò)程中，DNA 轉染試劑應保持4 ℃，同時(shí)電穿孔操作部位的溫度也應適當降低，Muramatsu 證明溫度較低的情況下，外源基因的轉移表達效率會(huì )有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時(shí)可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失，這樣也在一定程度上保證了基因的導入效率。
DNA 的狀態(tài)和濃度
很多試驗都證明線(xiàn)狀DNA 較環(huán)狀DNA 在活體電穿孔法瞬時(shí)表達系統的建立中效果較好[12 ] 。DNA 的濃度應在1～40mgPml 范圍內。
DNA 溶液組分
DNA溶液中不應含有不能分解成離子的組分，如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時(shí)會(huì )降低基因的轉移效率。
5、活體電穿孔法在不同組織上的應用
肌肉組織
在肌肉組織中*初進(jìn)行外源基因活體導入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因為肌肉組織在體內所占比例很大，約占40 % ，而且外源基因可在肌肉中長(cháng)期表達、分泌，在基因**中經(jīng)常會(huì )用到。此外，外源基因也不會(huì )因肌細胞的分裂而丟失。
皮 膚
皮膚組織相對于其他組織較難進(jìn)行電穿孔法的基因導入，因為皮膚比較薄，電阻相對低，要求電流較高。但如果電流過(guò)大，會(huì )嚴重影響基因的表達，因此應適當降低 電流和電壓，延長(cháng)電穿孔的時(shí)間。另外，由于皮膚組織含有的脂肪細胞分布不均，會(huì )干擾電穿孔的作用，因此只推薦用鑷狀電極，且應將動(dòng)物被毛刮凈后操作。雖然 外源基因在皮膚中表達的時(shí)間較肌肉中短，但可利用活體電穿孔法對很多皮膚**進(jìn)行**。
肝 臟
由于肝臟的生理代謝十分旺盛，因此外源基因在肝臟中的表達時(shí)間往往很短暫，而且表達產(chǎn)物的水平也較低。為減少出血，可從小靜脈注入，然后在肝臟上施加電場(chǎng)，能顯著(zhù)增強基因的表達。
睪 丸
相對于其他的轉基因方法，活體電穿孔法可使外源基因在睪丸中產(chǎn)生大量和持久的表達。此外，很多研究人員希望利用活體電穿孔法將外源基因導入精子， 進(jìn)而通過(guò)授精得到轉基因動(dòng)物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手術(shù)法將動(dòng)物人為造成隱睪，大部分體細胞和分化了的精母細胞減少，這樣使外源基因導入精原細胞的幾率增加。Ryoki 等[14 ] 將基因與病毒誘導的整合酶基因共轉染，可在精原細胞中檢測到外源基因的表達，且病毒誘導的雙基因共轉染較單基因整合效率更高。但目前用這種方法獲得轉基因 動(dòng)物還較難。
禽類(lèi)輸卵管
對禽類(lèi)輸卵管活體電穿孔的研究很少，但這一方法卻有很廣闊的發(fā)展前景。因為輸卵管腺體細胞具有很強的分泌功能，可以將大量蛋白分泌到雞蛋中。也可以利用此 瞬時(shí)表達系統檢測含卵清蛋白啟動(dòng)子的載體功能。Park 等用活體電穿孔法以熒光素基因導入雞輸卵管上皮，檢測到熒光素活性約4500RLUPmg 組織[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽類(lèi)胚盤(pán)
這三種組織都是很脆弱的，如果實(shí)施基因槍法，會(huì )使靶組織因強烈的機械損傷而失去功能或直接導致發(fā)育停滯。Sakamoto 將血纖蛋白溶酶原激活因子基因導入眼睛中，有效抑制了眼睛在淤傷后血纖蛋白的反應。哺乳動(dòng)物胚胎的電穿孔操作包括離體和**內操作。禽類(lèi)胚胎基本是在蛋殼 中進(jìn)行電穿孔的，而且表達快速，Momose 等報道電穿孔施加后215 小時(shí)在雞胚中就可以檢測到外源基因的表達，這在使用病毒載體時(shí)也是不可能的。當電場(chǎng)被限定在一個(gè)很小的范圍內時(shí)，基因可以定點(diǎn)表達， 這是活體電穿孔法的又一優(yōu)點(diǎn)，Katahira 等[17 ] 證實(shí)可將外源基因導入雞胚大腦、心臟和一些微小組織(如中胚層，間充質(zhì)和體節) 中進(jìn)行表達。
6、 活體電穿孔法進(jìn)行基因**及外源基因表達的調控
6．1 活體電穿孔法在基因**方面的應用
原來(lái)在基因**中利用活體電穿孔法將抗體或化療**導入腫瘤中，促進(jìn)抗體和化療**的運送來(lái)進(jìn)行**，現在則以特異的外源基因替代了抗體的應用，簡(jiǎn)化操作步驟同時(shí)降低了費用。
首先，在皮膚瘤和腦瘤的**中，電穿孔法可有效地將**基因導入**部位。電穿孔法導入人單核細胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤后，該蛋白在腫瘤的局部表達，同時(shí)在基因導入的部位可觀(guān)察到巨噬細胞和白細胞的聚集。
同時(shí)有科學(xué)家從另一角度研究電穿孔對**腫瘤方面的作用，利用高電場(chǎng)強度的陡脈沖促使腫瘤細胞發(fā)生不可逆性電擊穿而*終死亡，這種方法很適于局部組織腫瘤的**。
此外，活體電穿孔法還可以參與癌癥的**，通過(guò)活體電穿孔法將基因導入機體后，導入組織可成為分泌抗體等物質(zhì)的臨時(shí)分泌器官，以抵**細胞的侵蝕或代償由于癌細胞的侵蝕而造成的機體多種生理機能的喪失。
除了可以利用活體電穿孔法對腫瘤進(jìn)行局部**外，還可以**機體的***系統和**系統的**?？稍跈C體局部以活體電穿孔法導入編碼分泌型蛋白的基因，這 種重組的**蛋白可以隨著(zhù)血液循環(huán)分布到全身各種組織和細胞進(jìn)行**。如在活體電穿孔骨骼肌導入EPO 基因后，可通過(guò)紅細胞比容值檢測到EPO 基因表達產(chǎn)物的增加。Yasui 等在小鼠體內檢測到活體電穿孔法導入的胃泌素基因的表達產(chǎn)物和人的單克隆抗體。
在不遠的將來(lái)，研究人員可以選擇機體的一種組織的某個(gè)位置作為活體電穿孔的靶位點(diǎn)，將**基因從該位點(diǎn)導入進(jìn)而表達，因此又可以把這個(gè)特殊的組織當作機體 的一個(gè)人造的***或**組織，對病人進(jìn)行相應的**?；铙w電穿孔法可對系統**產(chǎn)生作用并且**有效。將不同類(lèi)型的耐藥基因同時(shí)導入造血細胞，以擴大耐 藥范圍和進(jìn)行體內選擇是基因**的重要策略，這類(lèi)載體基因片段大多較長(cháng)，進(jìn)行傳統基因導入有一定的難度。有報道可以用活體電穿孔法將醛脫氫酶基因和多藥耐 藥基因共轉移并在PA317 細胞中獲得高效表達，轉導率達98 % ，測定**蛋白表達較常規方法增高4 倍。此外電穿孔法有很高的經(jīng)皮促滲作用，可進(jìn)行很多經(jīng)皮給藥的**。
6．2 基因**中外源基因表達的調控
研究人員大都不希望導入的外源基因過(guò)度表達，尤其在基因**中，我們希望外源基因表達的誘導和抑制能夠得到控制。目前這方面的研究主要包括兩個(gè)方面:效應 元件調節和生理活動(dòng)調節。效應元件的作用，例如類(lèi)固醇類(lèi)**誘導的效應元件中，在卵清蛋白啟動(dòng)子5′遠端019kb 處有一個(gè)雌**效應元件，將具有此元件的基因導入成年母雞后，在其皮下注射糖皮質(zhì)**和雌**，便可誘導外源基因的高效表達，表達量較未經(jīng)**誘導的對照 組增加10 倍。
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過(guò)電場(chǎng)作用，導入動(dòng)物目標組織或器官。由于這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用，并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡(jiǎn) 單，在直流電場(chǎng)作用的瞬間，細胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復。在此期間生物大分子如DNA 可通過(guò)這種微小的通道進(jìn)入細胞。近年來(lái)活體電穿孔法用于轉基因研究的報道不斷增多，在基因**方面的優(yōu)勢也日趨顯著(zhù)，是一種很好的活體基因導入方法。
活體電穿孔法可用于檢測瞬時(shí)表達系統中載體的表達狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因**方面有非常好的應用前景。因此目前國內外對活體電穿孔法介導外源基因轉移的研究越來(lái)越多。
2、活體電穿孔的法的特點(diǎn)
活體電穿孔法基因導入和表達效率較高，它的特點(diǎn)主要在以下幾個(gè)方面:
首先，靶器官的選擇面廣，理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。
在用于基因**方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細胞不能把所轉移基因的表達產(chǎn)物分泌到外周血液循環(huán)中，則在某種意義上說(shuō)已失去了 基因導入的價(jià)值，這在基因**中是關(guān)鍵性的問(wèn)題。當使用組織特異性表達載體時(shí)，研究人員應根據所構建的表達載體來(lái)選擇基因轉移和表達的靶器官組織。例如魚(yú) 精蛋白21 啟動(dòng)子可指導外源基因在精母細胞中特異性表達，以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚(yú)精蛋白21啟動(dòng)子的表達載體導入，獲得外源基因的表達量遠遠高于該基因在肝 臟和骨骼肌中的表達。
其次，對導入的外源基因片段的大小沒(méi)有限制，從幾KB 或十幾KB 的表達載體， 到100～200KB 的YAC、BAC基因組 ，都有成功導入并獲得表達的報道。
此外活體電穿孔法操作簡(jiǎn)單快速，電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘，而且DNA片段不需要特殊的純化操作。
但電穿孔法也存在一些的缺點(diǎn):首先，外源基因表達持續的時(shí)間很短，雖然外源基因導入后*快可在215 小時(shí)有表達，但大多1～2 月后表達量降至很低。外源基因表達的時(shí)間主要由于所構建的表達載體和基因導入的靶細胞組織器官不同而存在巨大差異。
由于應用不同的表達載體，Muramatsu 在小鼠肝臟進(jìn)行電穿孔7天后則檢測不到外源基因的表達，而Heller 21 天后還可以檢測到外源基因的表達。如果選擇代謝和酶活動(dòng)旺盛的組織器官如肝臟，則表達持續時(shí)間會(huì )較短，表達時(shí)間在1 個(gè)月以?xún)?，但以骨骼肌為靶組織，表達可持續15個(gè)月。
3、 活體電穿孔法與其他活體基因導入方法的比較
到目前為止，非病毒載體的活體基因導入方法有直接注射法、脂質(zhì)體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性，因此很難將這幾種方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較。
直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點(diǎn)或血管中，但此種方法不適合以肌肉作為靶器官，它的外源基因表達效率極低，僅為電穿孔法的百分之一。
脂質(zhì)體法：活體基因轉移法中脂質(zhì)體法更適宜較大面積組織的基因導入，但無(wú)法避免DNA濃度變低，在出血的情況下會(huì )使本來(lái)不高的DNA濃度更加降低，往往造成基因導入效率低。
基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質(zhì)地較堅韌的組織如皮膚，而視網(wǎng)膜、胚胎和禽類(lèi)的胚盤(pán)等組織會(huì )由于機械刺激和出血造成器質(zhì)性損傷或發(fā)育停滯，因而不能 用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發(fā)出到達組織表面大多只幾百微米的距離，較深層的組織不易操作， 表達效率也較低。
Muramatsu報道在材料一致的情況下，電穿孔法的基因導入和表達效率明顯高于其它方法，而且電穿孔法適合多種組織的操作[3 ] 。
4 、活體電穿孔法施加條件的研究
波型的選擇
在電穿孔過(guò)程中方波較指數衰減波更能獲得較高的基因表達。同時(shí)方波只要要求控制電壓和時(shí)間，十分直觀(guān)，而指數衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數，這樣的條件摸索過(guò)程中，方波較指數衰減波更易得到高表達。
電 壓
電穿孔時(shí)在能量導入一定的情況下設計施加電壓的值。電壓過(guò)低或過(guò)高都會(huì )影響外源基因的表達。電壓過(guò)低時(shí)，無(wú)法造成細胞膜表面狀態(tài)的改變，因而外源D 不能進(jìn)入細胞內。電壓過(guò)高時(shí)，局部組織積聚過(guò)多熱量，造成細胞的死亡或組織失去功能，即使外源基因導入細胞，也無(wú)法進(jìn)行正常的表達。哺乳動(dòng)物常用的活體電 壓大多為20～100VPcm ，*高電壓在250～750VPcm。
電穿孔次數和時(shí)間
有試驗證明，皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說(shuō)明電穿孔使皮下組織形成孔道，且其大小隨電穿孔而變大，經(jīng)過(guò)電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內表達。但電穿孔次數不能過(guò)多，否則會(huì )對局部的細胞組織造成不可逆的損害，基本應在10 次以?xún)龋?/span>
每組電穿孔時(shí)間應在20～100msec 。
能量的測算
電穿孔過(guò)程中能量的測算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時(shí)導入的能量，V 代表施加的電壓，T 代表電穿孔延續的時(shí)間，R 代表作用組織的電阻。試驗證明在導入能量一定的情況下外源基因轉移效率也相近。在此原則基礎上可根據不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時(shí)間。
溫 度
由于電穿孔瞬間在局部會(huì )產(chǎn)生大量熱，因此操作過(guò)程中，DNA 轉染試劑應保持4 ℃，同時(shí)電穿孔操作部位的溫度也應適當降低，Muramatsu 證明溫度較低的情況下，外源基因的轉移表達效率會(huì )有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時(shí)可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失，這樣也在一定程度上保證了基因的導入效率。
DNA 的狀態(tài)和濃度
很多試驗都證明線(xiàn)狀DNA 較環(huán)狀DNA 在活體電穿孔法瞬時(shí)表達系統的建立中效果較好[12 ] 。DNA 的濃度應在1～40mgPml 范圍內。
DNA 溶液組分
DNA溶液中不應含有不能分解成離子的組分，如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時(shí)會(huì )降低基因的轉移效率。
5、活體電穿孔法在不同組織上的應用
肌肉組織
在肌肉組織中*初進(jìn)行外源基因活體導入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因為肌肉組織在體內所占比例很大，約占40 % ，而且外源基因可在肌肉中長(cháng)期表達、分泌，在基因**中經(jīng)常會(huì )用到。此外，外源基因也不會(huì )因肌細胞的分裂而丟失。
皮 膚
皮膚組織相對于其他組織較難進(jìn)行電穿孔法的基因導入，因為皮膚比較薄，電阻相對低，要求電流較高。但如果電流過(guò)大，會(huì )嚴重影響基因的表達，因此應適當降低 電流和電壓，延長(cháng)電穿孔的時(shí)間。另外，由于皮膚組織含有的脂肪細胞分布不均，會(huì )干擾電穿孔的作用，因此只推薦用鑷狀電極，且應將動(dòng)物被毛刮凈后操作。雖然 外源基因在皮膚中表達的時(shí)間較肌肉中短，但可利用活體電穿孔法對很多皮膚**進(jìn)行**。
肝 臟
由于肝臟的生理代謝十分旺盛，因此外源基因在肝臟中的表達時(shí)間往往很短暫，而且表達產(chǎn)物的水平也較低。為減少出血，可從小靜脈注入，然后在肝臟上施加電場(chǎng)，能顯著(zhù)增強基因的表達。
睪 丸
相對于其他的轉基因方法，活體電穿孔法可使外源基因在睪丸中產(chǎn)生大量和持久的表達。此外，很多研究人員希望利用活體電穿孔法將外源基因導入精子， 進(jìn)而通過(guò)授精得到轉基因動(dòng)物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手術(shù)法將動(dòng)物人為造成隱睪，大部分體細胞和分化了的精母細胞減少，這樣使外源基因導入精原細胞的幾率增加。Ryoki 等[14 ] 將基因與病毒誘導的整合酶基因共轉染，可在精原細胞中檢測到外源基因的表達，且病毒誘導的雙基因共轉染較單基因整合效率更高。但目前用這種方法獲得轉基因 動(dòng)物還較難。
禽類(lèi)輸卵管
對禽類(lèi)輸卵管活體電穿孔的研究很少，但這一方法卻有很廣闊的發(fā)展前景。因為輸卵管腺體細胞具有很強的分泌功能，可以將大量蛋白分泌到雞蛋中。也可以利用此 瞬時(shí)表達系統檢測含卵清蛋白啟動(dòng)子的載體功能。Park 等用活體電穿孔法以熒光素基因導入雞輸卵管上皮，檢測到熒光素活性約4500RLUPmg 組織[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽類(lèi)胚盤(pán)
這三種組織都是很脆弱的，如果實(shí)施基因槍法，會(huì )使靶組織因強烈的機械損傷而失去功能或直接導致發(fā)育停滯。Sakamoto 將血纖蛋白溶酶原激活因子基因導入眼睛中，有效抑制了眼睛在淤傷后血纖蛋白的反應。哺乳動(dòng)物胚胎的電穿孔操作包括離體和**內操作。禽類(lèi)胚胎基本是在蛋殼 中進(jìn)行電穿孔的，而且表達快速，Momose 等報道電穿孔施加后215 小時(shí)在雞胚中就可以檢測到外源基因的表達，這在使用病毒載體時(shí)也是不可能的。當電場(chǎng)被限定在一個(gè)很小的范圍內時(shí)，基因可以定點(diǎn)表達， 這是活體電穿孔法的又一優(yōu)點(diǎn)，Katahira 等[17 ] 證實(shí)可將外源基因導入雞胚大腦、心臟和一些微小組織(如中胚層，間充質(zhì)和體節) 中進(jìn)行表達。
6、 活體電穿孔法進(jìn)行基因**及外源基因表達的調控
6．1 活體電穿孔法在基因**方面的應用
原來(lái)在基因**中利用活體電穿孔法將抗體或化療**導入腫瘤中，促進(jìn)抗體和化療**的運送來(lái)進(jìn)行**，現在則以特異的外源基因替代了抗體的應用，簡(jiǎn)化操作步驟同時(shí)降低了費用。
首先，在皮膚瘤和腦瘤的**中，電穿孔法可有效地將**基因導入**部位。電穿孔法導入人單核細胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤后，該蛋白在腫瘤的局部表達，同時(shí)在基因導入的部位可觀(guān)察到巨噬細胞和白細胞的聚集。
同時(shí)有科學(xué)家從另一角度研究電穿孔對**腫瘤方面的作用，利用高電場(chǎng)強度的陡脈沖促使腫瘤細胞發(fā)生不可逆性電擊穿而*終死亡，這種方法很適于局部組織腫瘤的**。
此外，活體電穿孔法還可以參與癌癥的**，通過(guò)活體電穿孔法將基因導入機體后，導入組織可成為分泌抗體等物質(zhì)的臨時(shí)分泌器官，以抵**細胞的侵蝕或代償由于癌細胞的侵蝕而造成的機體多種生理機能的喪失。
除了可以利用活體電穿孔法對腫瘤進(jìn)行局部**外，還可以**機體的***系統和**系統的**?？稍跈C體局部以活體電穿孔法導入編碼分泌型蛋白的基因，這 種重組的**蛋白可以隨著(zhù)血液循環(huán)分布到全身各種組織和細胞進(jìn)行**。如在活體電穿孔骨骼肌導入EPO 基因后，可通過(guò)紅細胞比容值檢測到EPO 基因表達產(chǎn)物的增加。Yasui 等在小鼠體內檢測到活體電穿孔法導入的胃泌素基因的表達產(chǎn)物和人的單克隆抗體。
在不遠的將來(lái)，研究人員可以選擇機體的一種組織的某個(gè)位置作為活體電穿孔的靶位點(diǎn)，將**基因從該位點(diǎn)導入進(jìn)而表達，因此又可以把這個(gè)特殊的組織當作機體 的一個(gè)人造的***或**組織，對病人進(jìn)行相應的**?；铙w電穿孔法可對系統**產(chǎn)生作用并且**有效。將不同類(lèi)型的耐藥基因同時(shí)導入造血細胞，以擴大耐 藥范圍和進(jìn)行體內選擇是基因**的重要策略，這類(lèi)載體基因片段大多較長(cháng)，進(jìn)行傳統基因導入有一定的難度。有報道可以用活體電穿孔法將醛脫氫酶基因和多藥耐 藥基因共轉移并在PA317 細胞中獲得高效表達，轉導率達98 % ，測定**蛋白表達較常規方法增高4 倍。此外電穿孔法有很高的經(jīng)皮促滲作用，可進(jìn)行很多經(jīng)皮給藥的**。
6．2 基因**中外源基因表達的調控
研究人員大都不希望導入的外源基因過(guò)度表達，尤其在基因**中，我們希望外源基因表達的誘導和抑制能夠得到控制。目前這方面的研究主要包括兩個(gè)方面:效應 元件調節和生理活動(dòng)調節。效應元件的作用，例如類(lèi)固醇類(lèi)**誘導的效應元件中，在卵清蛋白啟動(dòng)子5′遠端019kb 處有一個(gè)雌**效應元件，將具有此元件的基因導入成年母雞后，在其皮下注射糖皮質(zhì)**和雌**，便可誘導外源基因的高效表達，表達量較未經(jīng)**誘導的對照 組增加10 倍。
