綠色熒光蛋白GFP的應用

1 綠色熒光蛋白GFP在分子生物學(xué)上的應用

1.1 綠色熒光蛋白GFP作為報告基因 

報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的DNA，如傳統的熒光素酶（LUX）基因和β-葡萄糖苷酶（GUS）基因。綠色熒光蛋白GFP作為基因報告可用來(lái)檢測轉基因效率，把綠色熒光蛋白GFP基因連接到目的基因的啟動(dòng)子之后，通過(guò)測定GFP的熒光強度就可以對該基因的表達水平進(jìn)行檢測。目前，此方法無(wú)論在農桿菌介導或基因槍介導的植物遺傳轉化中還是在活細胞、轉基因胚胎和動(dòng)物中都已得到非常廣泛的應用，特別是在活細胞基因表達的時(shí)空成像方面。

 1.2 綠色熒光蛋白GFP作為融合標簽

綠色熒光蛋白GFP*成功的一類(lèi)應用就是把綠色熒光蛋白GFP作為標簽融合到主體蛋白中來(lái)檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標記某些細胞器。在多數情況下，綠色熒光蛋白GFP基因在N-或C-末端與異源基因用常規的分子生物學(xué)手段就可以接合構成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現出與天然GFP相似的熒光特性。GFP的這種特性為蛋白質(zhì)提供了一種熒光標記，不僅可以檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移，還可以研究蛋白質(zhì)分子的相互作用以及蛋白質(zhì)構象變化，并依靠熒光共振能量轉移即FRET來(lái)進(jìn)行檢測。

2 作為生物傳感器

 2.1  檢測pH 

野生型GFP和其許多突變體都具有依賴(lài)于pH的熒光變化，因而可以被用來(lái)檢測活細胞內的pH。人們通常稱(chēng)它們?yōu)镻hluprin。分為兩類(lèi)：比率Phluorin和盈缺P(pán)hluorin。當pH降低時(shí)，比率Phluorin的*大激發(fā)波長(cháng)從395nm到475nm遷移，利用兩個(gè)***長(cháng)處的熒光強度的比率可以測量pH；當pH值小于6時(shí)，盈缺P(pán)hluorin在475nm處沒(méi)有熒光。當pH回復到中性時(shí)，兩類(lèi)Phluorin都會(huì )在20ms內復原。

2.2  檢測鹵素離子 

YFP（H148Q）變體不但對pH敏感而且對不同離子也同樣敏感，故可以用來(lái)檢測亞細胞結構中鹵素離子的濃度和傳遞

2.3  其他檢測應用 

另外，GFP可以應用于檢測電位、氧化還原水平以及在信號轉導中作為Ca2+指示劑

3 綠色熒光蛋白GFP在細胞生物學(xué)上的應用

綠色熒光蛋白GFP具有同宿主蛋白構成融合子的性質(zhì)，利用這一性質(zhì)，可以將GFP定位到特定的細胞器和膜系統中，進(jìn)行細胞生理過(guò)程、細胞動(dòng)力學(xué)等的實(shí)時(shí)觀(guān)測，或直接應用于定量分析。目前，GFP已經(jīng)被成功地用于靶向標記包括細胞核、線(xiàn)粒體、質(zhì)體、內質(zhì)網(wǎng)等在內的細胞器。用GFP進(jìn)行亞細胞定位，避免了提純蛋白、標記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或其他方式導入細胞的復雜方法，從而使研究蛋白在活細胞的準確定位變得簡(jiǎn)單易行。

 4  綠色熒光蛋白GFP在篩選方面的應用

 4.1 綠色熒光蛋白GFP用于細胞的篩選 

基于GFP的熒光特性，并且熒光穩定以及檢測方法快速、方便，GFP在細胞篩選上得到應用廣泛。 

4.2  綠色熒光蛋白GFP用于**的篩選 

利用GFP對目的物進(jìn)行標記，追蹤GFP，分析目的物在細胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而篩選出與體內信號分子功能相似的化合物