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胚胎顯微操作－細胞核移植
日期：2025-04-19 03:37
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摘要：
(一)概況
哺乳動(dòng)物核移植是指將胚胎單個(gè)卵裂球或體細胞核(核供體)移入去核的成熟卵母細胞或受精卵(核受體)中，采用一定的方法激活卵母細胞，使核供體和核受體融合為重構胚，經(jīng)移植后發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)。通過(guò)核移植，可以不經(jīng)過(guò)有性繁殖過(guò)程，連續不斷地復制遺傳上相同的胚胎，再借用胚胎移植技術(shù)，生產(chǎn)大量基因型相同的動(dòng)物系或動(dòng)物群體。根據核供體的不同分為胚細胞核移植(胚胎克隆)和體細胞核移植兩種。
*早的核移植試驗是用兩棲類(lèi)做的。Spemann于1938年通過(guò)結扎蠑螈受精卵，使其一分為二，有核的部分正常卵裂并發(fā)育到16細胞階段，此時(shí)將一個(gè)卵裂球的核移入無(wú)核部分，結果獲得了兩只幼蟲(chóng)。Gurdon于1962年報道了囊胚細胞核移植后獲得了具有繁殖能力的小蟾的試驗結果。兩棲類(lèi)核移植試驗為哺乳動(dòng)物核移植奠定了基礎。Illmensee和Hoppe于1981年獲得了核移植小鼠，Willadsen于1986年獲得了核移植綿羊。此后，牛、豬、兔、猴等動(dòng)物的胚細胞核移植也相繼獲得成功。國內在山羊、兔、小鼠、牛、豬等動(dòng)物均獲成功。
目前在牛上，胚胎連續克隆已可獲得第6代克隆胚胎和第3代克隆犢牛，由1枚供核胚連續克隆*多獲得了190枚克隆胚胎。我國在胚細胞核移植方面也取得了重大進(jìn)展，尤其在山羊胚細胞克隆方面處于****地位，已建立了山羊多個(gè)克隆胚胎系，可連續克隆5代，并獲得了后代，1枚胚胎經(jīng)5代連續克隆*多獲得了298枚克隆胚。此外，Wilmut等(1997)已成功地以綿羊乳腺細胞核為核供體，克隆出一只取名“多莉”的綿羊，**在哺乳動(dòng)物體細胞核移植方面獲得成功，這是核移植在理論和實(shí)踐上的重大突破。
胚胎細胞核移植技術(shù)對于畜牧業(yè)生產(chǎn)，科學(xué)實(shí)驗及生物學(xué)基礎理論研究都具有非常重要的意義，表現在：1．該技術(shù)可使具有優(yōu)良性狀個(gè)體的后代在群體中大量增殖，大大加速遺傳改良和育種進(jìn)程；2．可以迅速擴增轉基因動(dòng)物后代的數量，提高轉基因技術(shù)的效率；3．胚胎經(jīng)性別鑒定后再進(jìn)行核移植，可以獲得大量的期望性別的胚胎；4．核移植技術(shù)可用于**動(dòng)物品種的擴繁與保存；5．核移植技術(shù)對于實(shí)驗動(dòng)物科學(xué)也存很重要的意義，基因型相同的個(gè)體可提高實(shí)驗統計的有效性，從而可以大大減少試驗樣本的數目。
哺乳動(dòng)物核移植是指將胚胎單個(gè)卵裂球或體細胞核(核供體)移入去核的成熟卵母細胞或受精卵(核受體)中，采用一定的方法激活卵母細胞，使核供體和核受體融合為重構胚，經(jīng)移植后發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)。通過(guò)核移植，可以不經(jīng)過(guò)有性繁殖過(guò)程，連續不斷地復制遺傳上相同的胚胎，再借用胚胎移植技術(shù)，生產(chǎn)大量基因型相同的動(dòng)物系或動(dòng)物群體。根據核供體的不同分為胚細胞核移植(胚胎克隆)和體細胞核移植兩種。
*早的核移植試驗是用兩棲類(lèi)做的。Spemann于1938年通過(guò)結扎蠑螈受精卵，使其一分為二，有核的部分正常卵裂并發(fā)育到16細胞階段，此時(shí)將一個(gè)卵裂球的核移入無(wú)核部分，結果獲得了兩只幼蟲(chóng)。Gurdon于1962年報道了囊胚細胞核移植后獲得了具有繁殖能力的小蟾的試驗結果。兩棲類(lèi)核移植試驗為哺乳動(dòng)物核移植奠定了基礎。Illmensee和Hoppe于1981年獲得了核移植小鼠，Willadsen于1986年獲得了核移植綿羊。此后，牛、豬、兔、猴等動(dòng)物的胚細胞核移植也相繼獲得成功。國內在山羊、兔、小鼠、牛、豬等動(dòng)物均獲成功。
目前在牛上，胚胎連續克隆已可獲得第6代克隆胚胎和第3代克隆犢牛，由1枚供核胚連續克隆*多獲得了190枚克隆胚胎。我國在胚細胞核移植方面也取得了重大進(jìn)展，尤其在山羊胚細胞克隆方面處于****地位，已建立了山羊多個(gè)克隆胚胎系，可連續克隆5代，并獲得了后代，1枚胚胎經(jīng)5代連續克隆*多獲得了298枚克隆胚。此外，Wilmut等(1997)已成功地以綿羊乳腺細胞核為核供體，克隆出一只取名“多莉”的綿羊，**在哺乳動(dòng)物體細胞核移植方面獲得成功，這是核移植在理論和實(shí)踐上的重大突破。
胚胎細胞核移植技術(shù)對于畜牧業(yè)生產(chǎn)，科學(xué)實(shí)驗及生物學(xué)基礎理論研究都具有非常重要的意義，表現在：1．該技術(shù)可使具有優(yōu)良性狀個(gè)體的后代在群體中大量增殖，大大加速遺傳改良和育種進(jìn)程；2．可以迅速擴增轉基因動(dòng)物后代的數量，提高轉基因技術(shù)的效率；3．胚胎經(jīng)性別鑒定后再進(jìn)行核移植，可以獲得大量的期望性別的胚胎；4．核移植技術(shù)可用于**動(dòng)物品種的擴繁與保存；5．核移植技術(shù)對于實(shí)驗動(dòng)物科學(xué)也存很重要的意義，基因型相同的個(gè)體可提高實(shí)驗統計的有效性，從而可以大大減少試驗樣本的數目。
(二)核移植技術(shù)的操作過(guò)程
1．供體核的分離技術(shù)
(1)胚細胞
用0.2％鏈霉蛋白酶預處理胚胎，然后機械法剝離透明帶，鈍頭玻璃吸管反復吹吸以分離成單個(gè)卵裂球。有兩大重要進(jìn)展：1)胚胎干細胞系的建立——發(fā)育階段上類(lèi)似于內細胞團細胞，是早期胚胎經(jīng)體外分化抑制培養建立的多能性細胞系，可以傳代增殖，通過(guò)核移植可望獲得無(wú)數個(gè)遺傳上完全一致的動(dòng)物?，F僅在小鼠上獲得成功，在豬、牛、綿羊等家畜只分離到類(lèi)胚胎干細胞，是今后一個(gè)重要的研究方向。2)綿羊TNT4細胞系的建立一顯微分離胚盤(pán)細胞并在體外進(jìn)行缺血饑餓傳代培養，誘使細胞處于“靜止”狀態(tài)以便調整染色質(zhì)結構，有助于核的重組與發(fā)育，形態(tài)上類(lèi)似于胚胎干細胞，但更偏平、上皮化。該方法系Campbell等1996)所創(chuàng )立，曾被評為1996年世界十大科技新聞之—。
(2)體細胞
1997年，Wilmut等取綿羊乳腺細胞在特定實(shí)驗條件下增殖培養6天，誘使細胞處于“靜止”狀態(tài)，以便其染色質(zhì)結構調整，核進(jìn)行重組，經(jīng)核移植后獲得了后代，開(kāi)創(chuàng )了哺乳動(dòng)物體細胞核移植成功的前例。
2．受體細胞的去核技術(shù)
(1)以原核期受精卵或2細胞期胚胎為受體卵 去除原核或細胞核，成功率低，已很少采用。
(2)以排出卵為受體卵
將超排回收的卵母細胞或體外培養成熱的卵母細胞置于含細胞松馳素B和秋水仙胺的培養液中，通過(guò)操縱顯微操作儀，一端用固定吸管吸住胚胎，另一端用一尖玻璃吸管(Φ30um)穿透透明帶進(jìn)入卵周隙，或用一細長(cháng)玻璃針刺破并切一部分透明帶，再用呈直角的去核吸管經(jīng)切口抵住細胞膜，操縱去核吸管從第1極體處吸除第1極體以及處于分裂中期的染色體和周?chē)牟糠旨毎|(zhì)。
3．核卵重組技術(shù)
在顯微操作儀下，用去核吸管吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核卵母細胞的卵周隙中。
4．卵母細胞的激活與細胞融合
核移植技術(shù)操作過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是卵母細胞的激活及其與核供體的融合。人工激活卵母細胞的方法很多，如采用電刺激，改變溫度或滲透壓，透明質(zhì)酸醇，鈣離子載體，蛋白質(zhì)合成抑制劑等。電刺激激活卵母細胞的機理在于這一處理可使細胞內游離鈣的濃度升高，使細胞靜止因子(CSF)和成熟促進(jìn)因子(MPF)失活，從而解除CSF與MPF對卵母細胞分裂的抑制作用，使卵母細胞活化并完成**次減數分裂。電刺激的激活效果優(yōu)于其它幾種方法，在試驗研究中被廣泛采用。
核受體和核供體的融合一般采用兩種方法，一種是利用仙臺病毒誘導重組胚融合，另一種是電融合法，具有激活卵母細胞與誘導膜融合的雙重作用．即通過(guò)一定場(chǎng)強的直流脈沖刺激，使二者相鄰界面的細胞膜穿孔，形成細胞間橋從而達到融合。電融合是在由一種非電解質(zhì)(如0.3M的甘露醇)和兩根相近的微細電極(0.2～1mm)組成的融合小槽內進(jìn)行。融合過(guò)程中適宜的脈沖場(chǎng)強和持續時(shí)間是極其重要的兩個(gè)參數。在不同的畜種這兩個(gè)參數整異極大，而且還隨電極間的距離、融合液的種類(lèi)等變化。為了使細胞易于融合，需將卵母細胞和卵裂球緊密接觸，并且接觸面應垂直于電場(chǎng)方向。在上述兩種融合方法中，仙臺病毒為感染性病毒，其融合率低且不穩定，故已逐漸被舍棄。目前采用電刺激融合法，適宜的參數及熟練操作可使融合率達到96％。
5．核移植胚的培養與移植或重復克隆技術(shù)
融合后的胚胎經(jīng)體外或中間受體培養至桑椹胚或囊胚，然后移入與胚齡同期的受體動(dòng)物**角內，可望獲得克隆后代。獲得的早期胚胎也可以作為供體核重復克隆。
