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不經(jīng)顯微操作進(jìn)行體細胞克隆(徒手克隆)
日期：2025-04-18 23:33
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摘要：
本文描述了一種手工平分無(wú)透明帶卵母細胞的改進(jìn)核移植方法，Hoechst染色挑選胞質(zhì)體，以培養的原代顆粒細胞為體細胞與2個(gè)胞質(zhì)體進(jìn)行2次細胞融合。檢測微滴、穴中穴(WOW)和微管(GO)3個(gè)系統培養的無(wú)透明帶胚胎，胚泡率分別為0，18和36 ，方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟，有可能取代現有的體細胞核移植技術(shù)而大量應用。
影響反芻動(dòng)物體細胞核移植廣泛應用的主要技術(shù)障礙是：① 體外法效率低；②妊娠和產(chǎn)犢率低，出生后死亡及異常發(fā)育率高；③體外法所需實(shí)驗室設備費用高，技術(shù)難度大。顯微操作被認為是該工作中不可缺少的。此外，工具制作設備如研磨機，微鍛爐等的使用均需較高技術(shù)水平。這些要求相當程
度地限制了核移植技術(shù)的簡(jiǎn)化及廣泛應用。
Peura等(1998)建立了一種不經(jīng)顯微操作進(jìn)行牛胚胎細胞克隆的方法，用20~60細胞階段的卵裂球胚胎為供體。
用1016個(gè)卵母細胞進(jìn)行了7次重復核移植試驗，其主要步驟的平均效率和大概需要的時(shí)間見(jiàn)表1。棄去**極體不明顯的卵母細胞(占28%)。這些丟棄的細胞不能用于核移植，因此，沒(méi)有將其列入效率統計。在該過(guò)程完成后5rain觀(guān)察到丟棄細胞在均分期間發(fā)生分解。*終胞質(zhì)體選擇的準確度接近100％，盡管有9%的差別，這主要是因技術(shù)失誤及細胞估計數和實(shí)際獲得細胞數量間的差異而引起。細胞的丟棄幾乎都是在融合時(shí)因分解或技術(shù)失誤而引起。融合失敗(融合后15~20rain分離細胞對)的細胞對異常且在重復融合中通常被消除。
每個(gè)試驗平均用了105個(gè)卵母細胞并形成35個(gè)胞質(zhì)體一胞質(zhì)體一顆粒細胞3聯(lián)體。每次試驗時(shí)間不超過(guò)3h。分別在3個(gè)培養系統中培養，其胚胎發(fā)育率見(jiàn)表2。除培養在微滴與WOW培養系統中胚胎卵裂率(2個(gè)或2個(gè)以上細胞)外，其余數值都差異顯著(zhù)。一般來(lái)說(shuō)，微滴中培養的胚胎沒(méi)有超過(guò)8~16細胞階段；僅在WOW或GO系統中能發(fā)育到致密期。通常在胚胎重組后第6 d開(kāi)始形成胚泡，到第7d結束。因滋養層細胞將30％左右的胚胎粘在培養皿表面，因此在wOw系統中移去胚泡有些困難。但GO系統可避免這些問(wèn)題。
不需顯微操作體細胞核移植的利益和前景遠大。當前的成果包括降低裝備費用，簡(jiǎn)化預備工作及實(shí)驗技術(shù)要求低。任何做過(guò)胚胎方面試驗和口吸管方面工作的人都能很快掌握。盡管用卵母細胞試驗的直接工作沒(méi)有顯著(zhù)減少，但降低了這些工作的技術(shù)難度。此外，與早期的技術(shù)相比，預備工作如制作工具可以省略。然而，應該注意到產(chǎn)生三倍體需要較多的卵母細胞。無(wú)透明帶的胚胎可能有利于嵌合體的制作，克隆方法的簡(jiǎn)化也將有利于核移植的自動(dòng)化。在卵母細胞成熟期間，用于建立該方法的供
體細胞是貼壁的原代培養的顆粒細胞，這些細胞并不是都很適合做供體。隨著(zhù)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，可能能用不同器官組織的傳代細胞和血清饑餓培養的細胞。
總之，這種新穎、簡(jiǎn)單的體細胞核移植方法的出現，將大大降低目前核移植對昂貴且操作技術(shù)難度大的顯微操作儀的依賴(lài)。本文報道的初步試驗結果表明，該方法在體細胞克隆技術(shù)方面的發(fā)展具有相當大的潛力，滿(mǎn)足農業(yè)領(lǐng)域內克隆技術(shù)廣泛應用的需要。上述方法的可行性需要通過(guò)這些移植胚胎妊娠(目前正在獲取)和產(chǎn)出健康后代的數據來(lái)證實(shí)。)摘自《國外畜牧科技》
