顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù) 顯微操作技術(shù)（MicromanipulationTechnique）是指在高倍倒置顯微鏡下，利用顯微操作器（Micromanipulator），控制顯微注射針在顯微鏡視野內移動(dòng)的機械裝置，用來(lái)進(jìn)行細胞或早期胚胎操作的一種方法。

目前，以細胞內微注射和微灌注技術(shù)為基礎的玻璃針頭(GlassNeedle，精細的玻璃微量毛細移液管)的使用，已經(jīng)在越來(lái)越多的實(shí)驗生物學(xué)研究領(lǐng)域中成為一項非常普遍的操作方法，比如在體外受精、轉基因中等等。描述這些技術(shù)*恰當的話(huà)應當稱(chēng)其為---顯微操作，因為這些操作是通過(guò)單個(gè)的或多個(gè)的筒狀玻璃微量移液管、**的定位裝置（顯微操作器）以及微量注射器或微量灌注器來(lái)在單個(gè)的細胞上進(jìn)行的。

顯微操作技術(shù)包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等，例如多莉羊就是運用細胞核移植技術(shù)而成功的；而轉基因技術(shù)指的是將外源基因導入體細胞并能穩定的嵌入宿主動(dòng)物的生殖細胞染色體中的一門(mén)技術(shù)，基因轉殖動(dòng)物被定義為由人為的方式將外源基因引入體內而引起基因改變的動(dòng)物，并可將遺傳特質(zhì)傳遞到接續的每一世代中。

 微注射應用的范圍非常廣泛，從輔助（體外）細胞受精技術(shù)至分子和細胞基本組分的轉運都需使用這一技術(shù)，比較典型的是將某些物質(zhì)注射進(jìn)細胞中以操作和/或監測某種特定的存活細胞中的基本機體生物化學(xué)狀態(tài)。這些可以注射進(jìn)細胞的物質(zhì)包括有：各種細胞器、激酶、組織化學(xué)標志物（比如辣根過(guò)氧化物酶或者熒光黃）、蛋白質(zhì)、代謝物質(zhì)、微磁頭、離子、抗體、基因、分子生物學(xué)的mRNA和DNA等等。運用這一技術(shù)，也可以實(shí)現用于單個(gè)細胞或一組細胞的較少量（皮升至毫升）藥劑或**的**輸送（微灌注），例如藥理學(xué)的**檢驗。轉基因動(dòng)物的制作，可以利用基因微注射（gene microinjection）、胚干細胞（embryonic stem cells,ES cells）、精子載體（sperm vector）、反轉錄病毒感染（retroviral vectorinfection）及體細胞核移置（somatic cell nucleartransfer）等方法達成，其中顯微注射為目前應用*普遍之方法之一。

顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養的細胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組（rearrangement）、缺失（deletion）、復制（duplication）或易位（translocation）等現象而使外源基因嵌入宿主的染色體內。這種顯微注射術(shù)的程序，需有相當精密的顯微操作設備，制造長(cháng)管尖時(shí)，需用微量吸管拉長(cháng)器（micropipettepuller），注射時(shí)需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術(shù)的長(cháng)處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類(lèi)的細胞內。此法已成功運用于包括小鼠、魚(yú)、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉殖動(dòng)物。

以顯微注射法轉外源基因沒(méi)有長(cháng)度上的限制，目前已證明數百kb之DNA片段均可以成功產(chǎn)制出轉基因動(dòng)物。其缺點(diǎn)是設備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長(cháng)時(shí)間的練習，以及每次只能注射有限的細胞。這些操作中所使用的微量移液管是用毛細管拉針器(pipettepuller)來(lái)制作的，先將玻璃毛細管加熱到其熔化的溫度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關(guān)，它可以用于精準的移液。這種**度可以為各種類(lèi)型和任意大小的細胞提供亞皮克升級或0.1微米(micron)范圍內的**的、重復性良好的細胞內和細胞旁注射。通過(guò)運用直接的水壓（壓力注射）或者不通過(guò)使用水流，而通過(guò)施加一電場(chǎng)來(lái)使帶電離子運動(dòng)（離子電滲法），都可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴出去的效果。

目前*常用來(lái)生產(chǎn)轉基因動(dòng)物的方式為：直接把重組過(guò)的 DNA 注入授精卵的原核(pronuleus) 中，將從胚胎提供者的輸卵管中取得的授精卵移到倒置顯微鏡上的微量注射臺上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射針則依序穿過(guò) zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，將 DNA注入，注入時(shí)可以見(jiàn)到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的顯微注射為例，顯微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射針（injectionneedle）制備很困難，除影響操作時(shí)間外，也是影響轉基因效率及基因注入后之胚胎存活及轉基因成功與否極其重要的因子。固定吸管之內、外徑分別為30、80μm是較為合適的，顯微注射針自針尖起20μm處的外徑為4μm時(shí)，可獲得良好的轉染效率。固定吸管的內徑如果太小，會(huì )導致吸力不足，對受精卵操控不易；如太大，則受精卵易受傷害，影響胚胎的存活率。顯微注射針尖如果太粗，則導致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過(guò)多，受精卵易于裂解；太細則導致針內DNA流出速率過(guò)慢，且易阻塞，而使DNA無(wú)法順利流入原核內，影響注射效率。因此進(jìn)行受精卵雄原核的顯微注射時(shí)，如何制備適用固定受精卵的吸管及顯微注射針是關(guān)乎轉基因效率極其重要的因素。

 轉基因動(dòng)物（transgenicanimal）在目前生物及醫學(xué)研究方面的應用極為廣泛，轉基因小鼠一直是研究外源基因構筑型態(tài)、染色體嵌插、轉基因表現及調節的*佳模式，也是建立轉基因技術(shù)*好的工具，尤其是在轉基因家畜之前，先以小鼠進(jìn)行預備試驗是求事半功倍不可或缺的過(guò)程。

轉基因動(dòng)物應用的領(lǐng)域可以包括研究基因的活動(dòng)對致癌病毒與癌細胞的生長(cháng)的影響、基因的活動(dòng)與**細胞間的交互作用與調控的機制、研究基因對于生長(cháng)的調控機制，以及生物學(xué)與遺傳學(xué)的機制，也被應用于以人類(lèi)細胞作為組織及器官移植的發(fā)展方面，如基因參與體細胞、胚胎干細胞及存在各個(gè)組織的干細胞的體外誘導分化研究等等。轉基因動(dòng)物除用于一般基礎研究外，對于制造具有**效果的蛋白質(zhì)、器官移植、疫苗、毒理實(shí)驗、動(dòng)物品種改良及水產(chǎn)養殖等均有很大的貢獻。雖然截至目前為止，轉基因的研發(fā)已有若干良好的成果，但尚有若干問(wèn)題待克服，所以轉基因技術(shù)的應用與發(fā)展將是不可限量的。為了使科研人員能夠順利進(jìn)行上述的實(shí)驗并得到有意義的結果，這些實(shí)驗中所使用的設備不僅應當有特殊的功能，還應當同時(shí)有很高的、過(guò)硬的質(zhì)量，能夠提供確保結果正確所需的可靠性、**性以及可重復性。

美國哈佛儀器公司(HarvardApparatus)即生產(chǎn)并銷(xiāo)售可用于成功完成微注射和/和微灌注所需的整套產(chǎn)品．如Harvard/醫療系統 PLI－100皮升注射泵

在數字設定的時(shí)間間隔內，通過(guò)對其施加一定大小的壓力，PLI－100皮升注射器可以可靠地將一很大容積范圍內的物質(zhì)通過(guò)微量移液管進(jìn)行輸送。在固定細胞的同時(shí)，壓縮空氣使儀器的操作者能夠同時(shí)將毫微微升至毫升的所需容積的物質(zhì)準確地輸送至所需部位。不管您是需要將較大量的物質(zhì)注射進(jìn)移液管中，還是要將極少量的物質(zhì)注射進(jìn)哺乳動(dòng)物的細胞核中，PLI－100皮升注射泵都是您實(shí)驗的非常合適的選擇。

在一些很有聲望的***微注射實(shí)驗室，比如Cold SpringHarbor實(shí)驗室中，以及在世界范圍內的其他科研人員中，PLI－100皮升注射泵已經(jīng)成為大家所喜愛(ài)的產(chǎn)品。盡管其他公司也在試著(zhù)設計相似的微注射系統，但是就使用的簡(jiǎn)便性、**性以及成本的低廉性而言，PLI－100皮升注射泵仍然是無(wú)人可比的。  

適合用途：

――鼠類(lèi)、蛙類(lèi)、斑紋螺以及其他的卵母細胞的注射。

――腦細胞外注射。

――DNA、mRNA、微珠、神經(jīng)遞質(zhì)、各種激酶以及其他的蛋白質(zhì)的注射。